Ботаническая микротехника

  

 Авторская методическая разработка А.И. Михальцова

"Краткое руководство по изготовлению постоянных препаратов в области анатомии растений" (апрель 2011 г.)

При изготовлении постоянных препаратов для микроскопического анализа тканей растений важная роль отводится комбинированной окраске. Она позволяет на одном препарате выявить различные ткани для более детального изучения их анатомических особенностей. Окраска основана на разном сродстве тех или иных клеточных структур к различным красителям [Барыкина и др., 2004]. Так, лигнифицированные клеточные оболочки, имеющие кислую реакцию, хорошо окрашиваются основными красителями, а нелигнифицированные клеточные оболочки – кислотными.

Как правило, комбинированная окраска тканей растений двуцветная, получаемая с помощью двух контрастных по цвету красителей. Наиболее применимы следующие пары красителей: сафранин и водный синий (Прозина, 1960), сафранин и водный зелёный (Прозина, 1960), карболовый фуксин и пикроиндигокармин (Аксенов, 1967), алциановый синий и сафранин (D. a. J. Tolivia, 1987) и т.п. Наиболее известна и проста в применении комбинированная окраска по Этцольду [Etzold, 1983]. Это смесь трёх красителей в 2%-й уксусной кислоте: основной фуксин (1:10 000), сафранин (1:2500), водный синий (1:1000). В 2002 году Этцольд модифицировал свой метод окраски и предложил заменить сафранин хризоидином [Etzold, 2002]. Эта смесь также проста в применении, долго хранится.

С публикацией Робином Уокером нового метода полихромной окраски тканей растений для световой и флюоресцентной микроскопии [Wacker, 2006], вновь возрос интерес к применению акридиновых красителей в ботанической микротехнике. Уокер предложил использовать для окраски срезов растительных объектов следующие растворы красителей: акридиновый красный (1% раствор в 50% этаноле), акрифлавин (1% раствор в дистиллированной воде), астра-синий (1% раствор в дистиллированной воде). Акридиновый красный и акрифлавин являются также флюорохромами. Достоинством этого нового метода является насыщенность окраски клеток с лигнифицированными оболочками и возможность наблюдения препаратов с помощью люминесцентного осветителя. Сложность применения этого метода для многих исследователей состоит в поэтапном применении трёх красителей и необходимой дифференциации окраски. Метод был рекомендован для окраски объектов, прошедших проводку и заливку в парафин. Как известно, для процесса проводки, пропитки, заливки и резки на микротоме необходима специализированная лаборатория с дорогостоящим оборудованием. Кроме того, для депарафинизации срезов необходимо использование вредного для организма ксилола.

             Весной 2011 года мы приняли решение модифицировать метод Уокера, провели серию экспериментов по приготовлению постоянных препаратов. Основной целью работы являлось упрощение нового метода полихромной окраски. Эти красители мы смешивали - смесь №1.
             Кроме рекомендуемых Уокером красителей (акридиновый красный, акрифлавин, астра-синий), мы часто в полихромной окраске тканей используем четвёртый краситель - хризоидин, хорошо окрашивающий в оранжевый цвет кутикулу или другие красители.  Также мы иногда для полихромной окраски тканей растений используем другие комбинации красителей: №2 (альциановый синий, родамин B, акрифлавин); № 3 (альциановый синий, акридиновый красный, акрифлавин); №4 (астра-синий, сафранин, хризоидин, толуидиновый синий), №5 (сафранин, альциановый синий) и др.
         Михальцов А.И. разработал несколько авторских смесей красителей для полихромной окраски тканей растений: Mikhaltsov FSA, Mikhaltsov CRA, Mikhaltsov FRA (см. фото). Это готовые смеси, содержащие три красителя. Такие смеси хорошо использовать не только для научных целей, но и для занятий со студентами, школьниками.

        Приготовление препаратов – это целый ряд последовательных этапов, количество которых зависит от поставленных задач, в том числе, какие вы готовите препараты - временные или постоянные. В данном случае, я уделю внимание изготовлению постоянных препаратов, но БЕЗ проводки, пропитки и заливки в парафин, изготовления парафиновых блоков и т.п. Примеры изготовления постоянных препаратов приведу на научной работе обучающихся в нашей исследовательской лаборатории «Микрокосмос». Все фотографии выполнены нами.

 И так, считаем, что вы подготовили рабочее оборудование, красители и др. Приведём пример с использованием красителей, предложенных Робином Уокером, но метод модифицирован нами в начале 2011 года и опубликованный в 2012 году (Михальцов, 2012).

 Фото 1. Лаборатория "Микрокосмос".

Фото 2. Набор для изготовления постоянных препаратов (красители, реактивы и др.)

Материалы, оборудование.
Фиксированный или свежий растительный материал.
Реагенты.
Готовые красители: акридиновый красный (Acridinrot), акрифлавин (Acriflavin), астра-синий (Astrablau), толуидиновый синий (Toluidinblau), альциановый зелёный (Alciangruen), хризоидин (Chrysoidin), сафранин (Safranin), альциановый синий (Alcianblue) и др. Дистиллированная вода, этиловый спирт разной концентрации (70%, 50%, 30%), изопропиловый спирт 99, 7%, формалин (40%), ледяная уксусная кислота (99.5%), монтирующая среда Euparal.
Оборудование: микроскопы, ручной цилиндрический микротом или салазочный, одноразовые лезвия для микротомов, держатель одноразовых лезвий, часовые стёкла, чашки Петри, предметные и покровные стёкла, кисточки, препаровальные иглы, нагревательный столик, песочные часы, пинцеты, держатели, спиртовка, пипетки, термостат, блоки из стиропора, корнеплодов моркови.

 Основные этапы приготовления препаратов:

1. Выбор объекта и его подготовка: сбор, нарезка, фиксация.

Выбраны объекты: либо это стебли, либо листья, либо рахисы папоротников и т.д.
Есть два способа заготовки материала:
1) Нарезать кусочки стеблей, черешков длиной около 2 см и сразу поместить их в фиксатор на 5-7 суток.
2) Отрезать кусочки стеблей, листьев перед самой процедурой резки на микротоме, а затем тонкие поперечные срезы поместить в фиксатор.
Рекомендуемый фиксатор – FAA: этиловый спирт 70% - 100 мл.; формалин – 7 мл., ледяная уксусная кислота – 7 мл. Материал в этом фиксаторе можно держать до недели, а затем промыть этиловым спиртом и поместить 70%-й этиловый спирт.
На фото 3-4 показано как мы храним заранее фиксированный летом материал:

 Фото 3. Фиксированный растительный материал

Фото 4. Фиксированный растительный материал

 2. Приготовление рабочего места для изготовления препаратов.
Важно, чтобы во время приготовления постоянных препаратов вам никто не мешал, это опасно для рук во время резки материала на ручном микротоме или с помощью лезвий для бритья. Необходимо заранее сделать влажную уборку помещения, чтобы было меньше пыли и т.п.
Всё необходимое оборудование, реактивы, красители заранее проверяют перед работой.

3. Резка материала

Поперечный срез растительного материала можно проводить:
1) с помощью бритвы вручную.
         С помощью резки обычной опасной бритвой или лезвиями для бритья можно добиться вполне пригодных для изучения срезов толщиной 50-100 мкм, но надо «набить руку». Для резки твёрдого материала этот способ почти не пригоден, такие объекты необходимо заранее размягчить.
        Для объектов надо изготовить держатель - оправку. Можно использовать корнеплоды моркови, сердцевину стебля бузины, строительные материалы: стиропор, стиродур и т.п. То есть, материал для оправки надо подобрать так, чтобы твёрдость объекта приблизительно соответствовала твёрдости держателя (оправки).
В оправке вырезаем углубление в соответствие с формой объекта, закрепляем и плавными скользящими движениями нарезаем объект.
Такую же оправку можно использовать, если вы используете ручной или ротационный микротом.

 Фото 5. ручной микротом и лезвия. Обозначения: 1 - ручной микротом с микровинтовой подачей; 2 - держатель одноразовых лезвий; 3 - одностороннее лезвие для научной работы.

 Фото 6. Салазочный микротом.

Приготовим заготовки для изготовления оправки:

Фото 7. Заготовки из стиропора и корнеплоды моркови

Далее из заготовок нарезаем блоки, которые по размерам подходят к микротому, разрезаем их на две равные половинки и в них вырезаем углубления под конкретный объект:

Фото 8. Готовые оправки.

2) Резка с помощью ручного цилиндрического микротома или салазочного микротома.
Зажимаем объект в оправке, вставляем в микротом, выравниваем объект путём 1-2 срезов, регулируем толщину среза с помощью микровинта, смачиваем водой объект и лезвие, плавно двигаем лезвие, срез снимаем мягкой тонкой кисточкой.

 Фото 9. Резка на ручном микротоме.

Фото 10. Резка на ручном закреплённом на столе микротоме.

Фото 11. Приблизительно так выглядит объект в оправе, помещённой в ручной микротом.

Очень часто для выполнения исследовательской работы необходимо изготовить серию срезов.

Это сложный процесс, поэтому обучающиеся лаборатории "Микрокосмос" выполняют эту работу индивидуально и под наблюдением преподавателя.

 Фото 12. Юный исследователь Синицина Мария выполняет серию срезов рахисов папоротников.

4. Подготовка материала к окраске.
Если срезы делаем со свежего, а не фиксированного материала, то рекомендую следующий рабочий план:
• сами срезы сразу помещаем в фиксатор FAA на 15-20 минут.
• далее cрезы промываем в 70% этаноле 3 минуты.
• срезы промываем в 50% этаноле 3 минуты.
• срезы промываем в 30% этаноле 3 минуты.
• срезы промываем в дистиллированной воде и оставляем их там до этапа окраски.

 Фото 13. Фиксация срезов из свежего растительного материала

5. Окраска срезов.
         В данном примере привожу модифицированный нами метод окраски Уокера. Естественно, можно выбрать более простой вариант комбинированной окраски. Особенно проста комбинированная окраска по Этцольду или лучше использовать смеси Mikhaltsov FSA, Mikhaltsov CRA, Mikhaltsov FRA. Там достаточно пару капель на срез, подержать срез в смеси красителей 15-20 минут, промыть от остатков красителей и можно далее изготовить временные препараты (помещаем окрашенный срез в каплю воды на предметном стекле, накрываем покровным и смотрим при малом увеличении микроскопа, затем при большом увеличении), можно и постоянные.
      Метод полихромной окраски с применением акридинового красного, акрифлавина, астраблау был опубликован Уокером в 2006 году, сам метод рекомендован для окраски срезов после заливки в парафин. Этот метод для хорошо подготовленных специалистов или продвинутых любителей. Пока его редко используют.
       Мы модифицировали этот метод весной 2011 года, чтобы окраску можно было проводить всем, кто пожелает это делать, если есть набор таких красителей. Кроме того, все красители нами смешиваются, несмотря на то, что обычно не рекомендуют это делать в виду химической реакции между красителями и выпадения осадка (Михальцов, 2012). Срезы помещали в часовые стёкла, куда предварительно наливали растворы красителей, считая капли (см. выше смесь №1).

 Фото 14. Красители

Затем эти красители смешивали между собой и добавляли дистиллированную воду.
В эту смесь помещали срезы:

 Фото 15. Срезы и смесь красителей.

Для ускорения реакции окраски часовые стёкла нагревали над огнём спиртовки до 50-60 ºС в течение нескольких секунд, после чего процесс окраски продлевали до 15-20 минут при комнатной температуре или помещали на нагревательный столик:

 Фото 16. Поддержка температуры красителей на нагревательном столике.

Затем раствор красителя сливали и промывали срезы в дистиллированной воде несколько раз, пока не станет видно, что излишки красителей уже не вымываются. 

 Фото 17. Промывка окрашенных срезов в дистиллированной воде.

А далее идёт процесс дифференцировки окраски - это отмывка лишнего красителя и получение необходимого оттенка окраски тканей. Этот процесс проводили в течение 10-50 секунд (время зависит от многих факторов) в подкисленном соляной кислотой 70 %-ом этаноле. Эту процедуру следует проводить при непосредственном контроле через стереомикроскоп. Процесс дифференцировки можно проводить подкисленной дистиллированной водой, но этот процесс более продолжителен по времени.
Этот процесс наиболее важен и подбирается опытным путём...

 6. Обезвоживание материала.
Мы полностью исключаем "батарею" спиртов разной концентрации, заменив их почти 100%-м изопропиловым спиртом. Работаем по следующей схеме:
- 10 сек. в изопропаноле – смена раствора;
- 30 сек. в свежем изопропаноле– смена раствора; 

- 1 мин. в свежем изопропаноле - смена раствора;
- 3 мин. в свежем изопропаноле – смена раствора;
- 5 мин. в свежем изопропаноле – смена раствора.

 Фото 18. Обезвоживание окрашенных срезов.

Срезы оставляем в изопропаноле, пока готовимся к следующему этапу.

 Фото 19. Срезы в изопропаноле

7. Заключение в монтирующую среду.
       Если у вас монтирующая среда типа канадского бальзама или малинола, то изопропиловый спирт необходимо заместить ксилолом (помните о вентиляции!).
    Если вы используете монтирующую среду типа Эупараль, то эта среда совместима с изопропиловым спиртом.
   На заранее подготовленные (обезжиренные, промытые) и временно подписанные предметные стёкла наносим 1-2 капли монтирующей среды, мягкой тонкой кисточкой переносим в неё заранее выбранные хорошие срезы, слегка их прижимаем к стеклу, располагаем срезы как нам необходимо и накрываем покровным стеклом (помните, что покровное стекло надо ставить на ребро, окунув в монтирующую среду, а затем плавно опускать стекло, чтобы не было пузырьков воздуха). Покровное стекло слегка придавливаем обратной стороной кисточки, помещаем на него небольшой груз и ставим препараты в тёплое место, где меньше пыли. Обычно монтирующие среды подсыхают около 5-7 суток. 

 Фото 20. Подготовка к монтажу

Фото 21. Заключение окрашенных срезов в монтирующую среду

Фото 22. Окрашенные срезы в монтирующей среде.

А далее готовые препараты помещаем на нагревательный столик или в термостат.

 Фото 23. Сушка препаратов.

       После того, как монтирующая среза высохнет, её излишки, попавшие на предметное стекло, можно аккуратно срезать лезвием. Готовые постоянные препараты надо просмотреть, наклеить постоянную бирочку с текстом: название объекта, дата сбора и окраски, метод окраски, автор работы и т.п.

Фото 24. Готовый постоянный препарат.

Посмотрим этот препарат с помощью микроскопа:

 Фото 25. Сектор готового постоянного препарата. Срез стебля Berberis vulgaris (Барбарис обыкновенный).

 

Фото 26. Готовый постоянный препарат.

 Смотрим препарат с помощью микроскопа:

Фото 27. Сектор готового постоянного препарата. Срез стебля Berberis vulgaris (Барбарис обыкновенный).
 

Фото 28. Готовый постоянный препарат поперечного среза стебля Элеутерококка

Смотрим препарат с помощью микроскопа:

Фото 29. Сектор поперечного среза стебля Eleutherococcus.

 

 

Фото 30. Постоянный препарат поперечного среза хвоинки Pinus heldreichii 'Den Ouden'

 

 Смотрим препарат с помощью микроскопа:

Фото 31. Микрофото поперечного среза хвоинки Pinus heldreichii 'Den Ouden'

 

Фото 32-34. Готовые препараты перед наклейкой табличек. 

 

 

 

Фото 35-36. Готовые препараты с наклеенными табличками. 

Думаю, что подобные препараты должны использовать образовательные учреждения :)

Подведём некоторые итоги:
Микроскопическое изучение окрашенных тканей растений позволяет сделать выводы о том, что модификация нового метода полихромной окраски тканей растений имеет ряд положительных моментов:
1. экономия реактивов для фиксации и проводки материала;
2. существенная экономия времени для изготовления постоянных микропрепаратов;
3. исключение из процесса изготовления постоянных препаратов вредного для организма ксилола;
4. доступность метода.

Список литературы
Барыкина Р.П. и др. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. - М.: Изд-во МГУ, 2004. 312 с.
Михальцов А.И. Модификация нового метода полихромной окраски тканей растений. Природные ресурсы, биоразнообразие и перспективы естественнонаучного образования: Материалы международной научно-практической конференции, посвящённой памяти И. В. Бекишевой – учёного и педагога. Омск, 2012. – с. 57 – 59
Etzold H. Eine kontrastreiche, simultane Mehrfachfärbung für pflanzenanatomische Präparate: Fuchsin-Safranin-Astrablau // Mikrokosmos, Jg. 72, 1983, S. 213-219.
Etzold H. Simultanfärbung von Pflanzenschnitten mit Fuchsin, Chrysoidin und Astrablau // Mikrokosmos. Jg. 91, 2002, S. 316-322.
Wacker R. Eine neue und einfache Methode zur polychromatischen Anfärbung von Paraffinschnitten pflanzlicher Gewebe für Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie // Mikrokosmos Heft. 2006, № 4. S. 210-212.